Wie wird auf COVID-19 getestet?

Ein Test auf eine Virusinfektion hat zwei Ansatzpunkte¹:

• Direkter Nachweis des Erbmaterials des Virus.
• Nachweis von Antikörpern gegen den Virusproteinen.

Direkter Nachweis des Virus RNA

Basis dieses Verfahrens ist die sog. Polymerase Ketten Reaktion² (PCR auf Englisch). Mit der PCR kann man kleinste Mengen eines DNA-Stücks, z.B. ein Gen, vervielfältigen soweit man die Sequenz der DNA Basenpaare (Nukleotiden) dieses Stücks kennt. Erforderlich für die Vervielfältigung mittels PCR ist eine Enzym aus der Familie der DNA Polymerasen. Seit dieser Entdeckung (siehe Referenz 2) sind diese Enzymen weiter entwickelt und kommerziell erhältlich.

Um aus der großen Anzahl der DNA-Molekülen, die sich in einer Zellprobe befinden können, den richtigen Strangteil zu finden und die Vervielfältigung an der richtigen Stellen zu beginnen, braucht man sog. Primer³. Diese Primer sind kurze einzelsträngige DNA Stücke, typisch 18-30 Nukleotiden, die komplementär zu den gesuchten Strang sind und nach Aufspalten der DNA, binden. Danach kann die Polymerase loslegen und wieder einen Doppelstrang aufbauen. Typisch ist eine Länge von 3000 Basenpaare. Danach wird der neue Doppelstrang wieder aufgeteilt und der Prozess geht wieder von vorne los. Durch exponentielle Multiplikation kann man eine ausreichende Menge des gesuchten DNAs generieren. Die heißt dann cDNA.

Heutzutage ist PCR Stand der Technik in der Genetik. Es gibt viele Anwendungen, z.B. für Täteridentifizierung in der Forensik, oder für Vaterschaftstest. Die PCR wird in kommerziell erhältliche Automaten durchgeführt, die sämtliche Prozessschritte übernehmen. Alle notwendige Ingredienzen wie die Enzymen sind kommerziell verfügbar. Primer müssen für jeden Zweck synthetisiert werden wofür es auch sog. DNA-Synthesizer gibt.

Das Corona-Virus gehört aber zur Familie der RNA Viren. Da RNA einzelsträngig ist, kann die PCR prinzipiell nicht verwendet werden. Aus der Probe (Abstrich oder Speichel) werden die Zellen aufgeschlossen und das Erbmaterial extrahiert. Die RNA des Corona Virus ist in der Mischung vorhanden aber in eine sehr geringe Konzentration wodurch das Virus RNA nicht direkt nachgewiesen werden können. 

Um dennoch PCR in der molekularen Diagnostik einzusetzen, wird ein Trick angewandt. Bekanntlich wird bei Genexpression, die DNA abgelesen und wird durch ein Enzym, RNA-Polymerase, den sog. mRNA gebildet, woraus die Zelle ein Protein bilden kann. Man hat in der Forschung von RNA Viren ein Enzym gefunden, das den umgekehrten (reverse) Weg geht und aus der RNA, doppelsträngiges DNA bilden kann⁴. Nach weiterer gentechnischen Entwicklung wurde daraus Enzymprodukte generiert, die man bei der molekularen Diagnostik von Viren einsetzt. Diese Entdeckung hat auch geführt zur Entwicklung von Arzneimitteln, die die Transkriptase in eine infizierte Wirtszelle hemmen kann und z.B. bei der Behandlung von AIDS und Ebola einzusetzen.

Die Reverse Transkriptase in Kombination mit PCR bildet die RT-PCR Diagnostik⁵ und ist die Methode der Wahl zum Nachweis des Erbmaterials eines Virus in den Zellen eines Organismus.

Im Falle des aktuellen Corona Virus wurde von Droste und Mitarbeiter ein Testverfahren entwickelt und publiziert⁶. Zuerst hat diese AG die Genen dieses Virus kartiert und für den Nachweis ausgewählt⁷. Auf Basis davon wurden die Primer definiert und von einer Firma in Berlin hergestellt.

Eine weitere Methode wurde von der Hongkong Universität publiziert⁸  Die Verfahren sind somit öffentliche Protokolle die über die WHO publiziert wurden und jedes Labor zur Verfügung stehen. Deshalb kann man davon ausgehen, dass Labors aufrüsten und Testkapazität erweitern soweit sie Personal mit Erfahrung und Kompetenz in dieser Technik haben. Dennoch soll man in diesem Moment Vorsicht walten lassen. Falsch-positiv bzw. falsch-negativ Resultaten müssen bestimmt werden und Kreuzreaktionen auf andere Viren ausgeschlossen.

In Zusammenarbeit mit ihrem Partner Randox hat Bosch Healthcare ein Gerät, Vivalytic, angekündigt was ein Schnelltest auf  Corona Virus auf Basis der RT-PCR Methode angekündigt der wohl bald verfügbar sein wird. Das Gerät kann 1 Probe in 2.5 Stunden bearbeiten. Es ist ein Geraet was eher fuer eine sog. Point-of-Care Praxis gedacht ist.

Frage ist, ob die vorhandenen Diagnostik-Automaten die starkwachsende Probenzahl verarbeiten können. Und insbes. ob die erforderlichen Enzymen auch verfügbar bleiben. 

Eine sehr anschauliche  Darstellung der RT-PCR Test wurde auf den Webseiten von Compound Interest publiziert.  Zwar in englischen Sprache aber verständlich aber sehr stark empfohlen an zu klicken. 

Nachweis von Antikörpern gegen Virusproteinen

Antikörper sind Proteinen mit einem sehr hohen Molekulargewicht und haben deshalb einen komplexen chemischen Struktur⁹. In einem Organismus stellen sie quasi die ersten Verteidigungslinie gegen Eindringlingen wie z.B. Bakterien und Viren. Solche Eindringlingen bestehen selbst auch Proteinen mit hohem Molekulargewicht. Als Beispiel die Hüllen Proteinen eines Virusteilchen. Diese werden als Antigenen bezeichnet. 

Die Anwesenheit von Antikörpern im Blut eines Organismus ist Nachweis einer Infektion hinterher. Unter gewisse Voraussetzungen können AKs aber auch als Therapiemittel eingesetzt werden (in einer der nächsten Beiträge). Das wurde bereits im 19. Jahrhundert von Paul Ehrlich erkannt, der mit Sera von genesen Diphterie Patienten neu Erkrankten genesen konnte und worüber in der ARD-Serie Charité Berlin erzählt wurde.

Vordergründig werden Antikörper in der Forschung von Biopharmazeutika, biochemischer Analytik und molekularen, klinischer Diagnostik eingesetzt. Aber wie bekommt man diese Substanzen? Die entscheidende Arbeit wurde von Köhler und Milstein publiziert in 1975, wofür beide später den Nobelpreis erhielten. Die Blutzellen welche die Antikörper produzieren, die β-Lymphozyten, können nicht in eine Zellkultur wachsen. Tumorzellen dagegen haben ein ewiges Leben in einer Kultur. Köhler und Milstein ist es gelungen, diese beide Zell Typen zu fusionieren zu sog. Hybridoma oder Zellklonen.

Nun muss man für jeden Antikörper, den man benötigt das Antigen und den entsprechenden β-Lymphozyten haben. Das Antigen ist z.B. ein Teil des Hüllenproteins eines Virus. Dieses Antigen wird einem Versuchstier, z.B. einem Maus,  eingespritzt, der damit immunisiert wird.  Eine recht übersichtliche Beschreibung dieses Verfahrens findet man im Schülerlexikon der Lernhelfer¹⁰. Eine Differenzierung hierzu ist wichtig zwischen Polyklonalen und Monoklonalen Antikörpern. Letztere sind ganz Spezifik gegen ein Antigen gerichtet und sind besonders wichtig in der Krebstherapie.

 Es sind viele Molekular-Biologische Test entwickelt wo AKs zum Einsatz kommen. Für diese Molekulardiagnostik ist einer weltweite Industriezweig entstanden, die Automaten, Hilfsmittel und erforderliche Bioreagenzien anbietet (z.B. Euroimmun, Lübeck). Der Test wird durchgeführt in einem Labor-Automat. Für bekannte Infektionen (bakteriell oder viral) werden von alle Hersteller dieser Automaten validierte und zertifizierte Test Kits angeboten mit fertige Protokolle. Bei einem neu-auftretenden Virusinfektion, erstmal Protokolle aus der Fachliteratur befolgt werden muss, um einen neuen Test zu entwickeln. Danach muss der Test validiert, Anteil falsch-positiven und falsch-negativen Resultaten bestimmt, zertifiziert und zugelassen werden bevor der auf den Mensch angewandt werden kann. So auch bei COVID-19

Ganz aktuell wurden AK-Schnelltests für COVID-19 Proteinen angekündigt. Z.B. Becton-Dickinson Co., in USA. Es sind aber Geräte womit nur eine Probe bearbeitet werden kann und in einen Arztpraxis zum Einsatz kommt. Auch diese Tests erfordern die Verwendung eines Testgerät. Eine Testmethode der ohne Gerät auskommt wurde in China vorgestellt.

Es ist wichtig kurz auf dem Testfahren einzugehen. Das Verfahren nennt sich Immunassay. Der meist eingesetzte Methode ist der ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay). In der Immunassay Methode wird entweder das Antigen an einem Substrate gebunden und die Anwesenheit des Antikörpers in der Probe (Serum aus dem Blut) gesucht oder es wird den Antikörper an einem Substrate gebunden und die Anwesenheit des Antigens in der Probe gesucht. Das Substrate ist die Oberfläche eines kleines Gefäß wovon 96, 384 in ein sog. Mikrotiter Platte vorhanden sind. Um  der Anwesenheit und Konzentration des Antigens/Antikoerpers zu bestimmen ist eine enzymatische Farbreaktion angekoppelt. Vier Ausfuehrungsweisen der Test habe ich im folgenden Bild von Wikipedia übernommen.

Ich verzichte auf weitere Einzelheiten der unterschiedlichen Verfahren. Die Hersteller von diese Labor Automaten liefern Protokolle. Man soll sich nur darüber im Klaren werden, was neben den Automaten erforderlich ist um eine AK-Test für COVID-19, Deutschland- oder Europaweit durchzuführen.

 

 

 

 

 

 

1. https://en.wikipedia.org/wiki/COVID-19_testing
2. https://de.wikipedia.org/wiki/Polymerase-Kettenreaktion
3. https://de.wikipedia.org/wiki/Primerdesign
4. https://de.wikipedia.org/wiki/Reverse_Transkriptase
5. https://de.wikipedia.org/wiki/Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
6. C. Droste et al., Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR
7. C. Droste et al., Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus:
8. Medical University of Hongkong Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases by RT-PCR
9. https://de.wikipedia.org/wiki/Antik%C3%B6rper
10. Schülerlexikon